In 1528 werd keizer Karel V, koning van Spanje, landsheer van Overijssel. Dit betekende het einde van de wereldlijke macht van de bisschop van Utrecht. Ook op religieus gebied waren er veranderingen ingezet, maar Filips II duldde geen andere godsdienst dan het rooms-katholicisme in zijn rijk. In 1568 kwamen de Nederlandse rijksdelen onder leiding van Willem van Oranje in opstand tegen zijn regering, het begin van de Tachtigjarige Oorlog. De provincie Overijssel sloot zich pas rond 1580 aan bij de opstand tegen het Spaanse gezag.
Onrustige tijd
Ootmarsum viel in deze onrustige jaren beurteling in Staatse en Spaanse handen. In 1571 werden de eerste Spaanse troepen in Ootmarsum gelegerd. Zij versterkten de vesting met kleine poortjes en bouwden wachthuisjes op de poorten en wallen. In die tijd was het gewoon dat legers zich inkwartierden bij welgestelde burgers. In 1573 moest de Commanderie een vendel Spaanse ruiters herbergen. In 1579 trokken Staatse troepen Twente binnen. Zij veroverden de Commanderie op de Spaanse troepen. Commandeur Bernhard de Bever klaagde dat zijn huis als gevolg van de oorlog bijna geheel verwoest was en zijn pachters hun hoeven ontvluchtten. Zelf verliet hij ook de Commanderie, want de gewapende overvallen en plunderingen maakten het huis te onveilig. In het voorjaar van 1580 kreeg "het Duitse Huis" inkwartiering van graaf Willem van Nassau met zijn troepen en werd de stad veroverd door de Staatsen. Nog in hetzelfde jaar volgde echter herovering door de Spanjaarden. Het was voor boeren en burgers een barre tijd, want in opdracht van de Staten Generaal werd in 1584 zelfs begonnen met het platbranden en verwoesten van delen van Twente, om het voor de Spanjaarden onbewoonbaar te maken. In dat jaar bezette de Spaanse veldheer Mendoza Ootmarsum; zijn hoofdkwartier was gevestigd in de Commanderie. Maar opnieuw keerde het tij. Ootmarsum werd op 30 juli 1592 ingenomen door prins Maurits, de opvolger van Willem van Oranje. De inname verliep zonder veel strijd, want commandant Mendoza was totaal onvoorbereid. De "bevrijding" was van korte duur. Al in 1593 werd Ootmarsum heroverd door de Spanjaarden.
Ootmarsum belegerd
Het duurde nog tot 1597 voor de Spanjaarden definitief uit Ootmarsum verdreven werden. Samen met de Friese stadhouder graaf Willem Lodewijk begon prins Maurits een groot offensief tegen de vijand. De veldtocht werd een succes. Na de val van Groenlo en Enschede besloot Maurits de steden Oldenzaal en Ootmarsum tegelijkertijd aan te vallen. Hij verwachtte dat de verdediging in beide steden sterk verwaarloosd zou zijn. Zelf nam hij Oldenzaal voor zijn rekening. De verovering van Ootmarsum liet hij over aan de drost van Salland, Gerard van Warmelo. Twee regimenten stonden op 19 oktober 1597 voor de poorten van Ootmarsum. Uit het ooggetuigenverslag van Anthonie Duyck, secretaris van Maurits, kunnen we het verloop van de aanval op de voet volgen. De stad werd opgeëist, maar de Spanjaarden en de bevolking wilden zich niet zonder slag of stoot overgeven. Zij begonnen vanaf de wallen onophoudelijk met musketten en geschut te vuren, waarbij gewonden vielen. De Staatsen dreigden de wal rond de stadsgracht te doorgraven en brachten vier stuks geschut in stelling. Na het lossen van de gebruikelijke drie sommeringschoten was de stad op 21 oktober tot overgave bereid. Het Spaanse garnizoen van 120 man sterk marcheerde onder vrijgeleide af. Maurits eiste dat de vesting Ootmarsum ontmanteld zou worden. Nadat de stad van alle verdedigingswerken was ontdaan, verloor Ootmarsum hiermee aanzienlijk aan militair-strategisch belang en daarmee aan stedelijk gevoel van eigenwaarde. Het lag voortaan net als het platteland open voor de vijand. Bij latere opgravingen en bebouwingen zijn verschillende ijzeren kogels teruggevonden in de buurt van de vroegere stadspoorten. Waarschijnlijk zijn deze bij de beschieting in de stadsgracht beland. Twee ervan zijn als blijvende herinnering aan de belegering ingemetseld in de zuidelijke muur van de rooms-katholieke kerk en in de buitenmuur van pand Grotestraat 21.
