De Tachtigjarige Oorlog bracht niet alleen rampspoed aan Haarlem. Door de aanhoudende geloofsvervolgingen in het zuiden en de relatieve geloofsvrijheid in het noorden, kwam er een enorme stroom vluchtelingen op gang die een belangrijke bijdrage leverden aan de wederopbouw van Haarlem. Rond 1625 bestond zelfs de helft van de Haarlemse bevolking uit Vlamingen. Het ging hierbij vaak om daadkrachtige mensen, met veel vakkennis, kapitaal en handelsrelaties. In allerlei opzichten drukten zij hun stempel op de stad.
Zo vestigde zich in 1583 de Vlaamse schilder, schrijver en dichter Carel van Mander in Haarlem en stichtte hier de eerste Nederlandse schildersacademie. Hij werd vooral beroemd door het Schilder-boeck (1604) waarin hij de levens van talloze schilders uit Oudheid en Renaissance beschrijft. Beroemder nog werd zijn leerling Frans Hals (1580-1666), eveneens een geboren Vlaming, die internationaal befaamd zou worden met zijn schutters- en regentenstukken. Lieven de Key, ook al uit Vlaanderen afkomstig, werd in 1593 stadsbouwmeester en bouwde de Vleeshal aan de Grote Markt, ontwierp vernieuwingen aan de Grote Kerk en bouwde de toren van de Nieuwe Kerk. Zo verwierf Haarlem nadrukkelijk een plaats in de Gouden Eeuw.
De basis voor die opbloei van kunsten en wetenschappen lag in de economische groei. Aan het Spaarne bloeide de scheepsbouw op; bierbrouwerijen profiteerden van het heldere water uit de duinen; allerlei ambachten en neringen floreerden. Maar het meest de aandacht trok de fabelachtige opkomst van de textielindustrie, zoals een aantal huidige straatnamen in de Vijfhoek nog laten zien (Vlamingstraat, Wolstraat, Drapeniersstraat en de Korte en Lange Lakenstraat). De welvaart die hiermee gebracht werd, bevorderde bovendien een heel bijzondere bedrijfstak, de bloembollenhandel. Vooral door de geschikte bodem in deze streken, bloeide de handel in tulpenbollen, een zeer geliefd handels- en zelfs speculatieobject (met een beruchte crisis in de 'tulpenmanie' in 1636-1637, toen – vergelijkbaar met het leeglopen van de 'internet-bubble' – de prijzen instortten). Desondanks is Haarlem een centrum gebleven in de teelt en handel in bolbloemen: nog steeds staat Haarlem bekend als 'bloemenstad'.
Haarlem bloeide dus op, al zou het niet meer een positie verwerven als tweede stad in Holland, zoals in de Middeleeuwen. Het zou in de Gouden Eeuw overvleugeld worden door Amsterdam.