Pas na de veldtocht van prins Maurits, die in 1597 het oosten van Twente onder controle bracht van de Republiek, kreeg het protestantisme hier voet aan de grond. De Grote Kerk ging in 1598 over in protestantse handen. Dat gebeurde waarschijnlijk zonder vernieling van heiligenbeelden en altaren, zoals elders in het land was gebeurd. In het aangrenzende deel van Duitsland (de graafschappen Steinfurt en Bentheim) ging de landsheer al in 1544 over tot het protestantse geloof. Na 1555 gold in Duitsland de regel "van wie het land is, is ook de godsdienst". Het graafschap vormde in die periode staatkundig een enclave in het verder katholieke prinsbisdom Munster. Veel Enschedese protestantse voorgangers kwamen dan ook uit Duitsland, waar zij een theologische opleiding hadden kunnen volgen.
Welgevallige predikatie
De eerste gereformeerde voorganger in Enschede (en Losser) was
Pibo Ovitius. Het stadsbestuur schreef over hem dat "sinne persoenn
uns wel ansteet" en dat zijn "praedicatione unde leerunge uns
wohlgefellig" zijn. Het collatierecht ‒ het recht
kerkelijke benoemingen goed te keuren ‒ bleef echter nog jaren
in handen van rooms-katholieke familie Van Loen. Ook de katholieke
kerkmeesters en de koster bleven in functie. Elke middag om 12 uur
bleef het Angelus kleppen! Door de overgang naar het protestantisme
moesten alle huwelijken, ook die van andersdenkenden, voortaan in
een gereformeerde kerk worden afgekondigd (en aanvankelijk ook
gesloten). Alleen gereformeerden konden worden benoemd in
overheidsambten. Onderwijzers dienden in het vervolg de
protestantse belijdenisgeschriften te onderschrijven en aanvullende
examens te doen. De verhoudingen lagen zodanig ingewikkeld dat de
gereformeerde gemeente pas in 1633 kon worden geïnstitueerd.
Schuilkerken
Hoewel officieel verboden, werd het katholieke geloof in de
praktijk gedoogd, mits men er in het openbaar geen uiting aan gaf.
In de Walstraat, aan Achter het Hofje en op Hof Espelo waren in de
loop van de eeuw schuilkerken; even over de grens (zoals in de
Knalhütte) zogenoemde. "kerkhuizen", waar missen werden gelezen en
sacramenten werden bediend.
De doopsgezinden weken in opvattingen en levensstijl nogal af van
de lutherse en gereformeerde protestanten. Radicale praktijken als
die van de "wederdopers" in Munster (1534-1535) waren de oorzaak
van vervolgingen op brede schaal, ook in de Nederlandse gewesten.
Vredelievende doopsgezinden (mennonieten) onder leiding van Menno
Simons uit Witmarsum kregen echter algauw de overhand. In boerderij
De Haimer in Twekkelo kwamen doopsgezinden bijeen, onder wie
vluchtelingen uit Duitsland, waar de Dertigjarige oorlog woedde.
Vanaf 1631 mochten zij met toestemming van de Staten van Overijssel
hun eredienst uitoefenen "in alle stilligheid en moderatie". In de
Achterstraat in Enschede (tegenover de huidige Menistenstraat) was
een kamer ingericht als "vermaning", voor hun erediensten.
Contrareformatie
In de periode 1605-1626, toen Twente deels weer onder Spaans
bestuur stond, trachtte Philippus Rovenius, vicaris-generaal van
het bisdom Deventer, vanuit Oldenzaal de katholieke kerk weer te
ontdoen van protestantse invloeden. In feite werd de Reformatie pas
hervat na de herovering van onder meer Enschede door Ernst Casimir
in 1626. Vooral het gebied rond Oldenzaal (ook Lonneker) is echter
tot op de dag van vandaag in hoofdzaak rooms-katholiek
gebleven.