Als je vandaag de dag om je heen kijkt, zie je weinig elementen die erop wijzen dat de Sint-Jan ooit een katholieke kerk geweest is. Alleen de glazen van voor 1572 wijzen daarop: ze verbeelden onder andere geestelijken en beschermheiligen. Voor de overgang van het katholicisme naar het protestantisme, ook wel de alteratie genoemd, ziet de kerk er heel anders uit. Overal staan altaren van verschillende gilden, vaak versierd door altaarstukken. Ze verbeelden vaak het leven van een heilige, Maria bijvoorbeeld.
De alteratie heeft een oorzaak, namelijk de Opstand in de Nederlanden, die resulteert in de oprichting van de Republiek. In 1572 is de stad Den Briel veroverd door de watergeuzen. Deze overwinning markeert het begin van de Opstand in de Nederlanden en de alteratie van veel belangrijke steden. De veroveringsdrang van de watergeuzen blijft niet beperkt tot Den Briel. Al snel is ook Gouda een doelwit van de geuzen. Vanaf die dag is Gouda officieel een protestantse stad.
De alteratie heeft grote gevolgen voor de kerk. Van de ene op de andere dag gaat de deur van de Sint-Jan op slot. De mis wordt niet meer opgedragen en er zijn geen diensten. Het moet voor de Goudenaren heel onwerkelijk geweest zijn dat hun kerk niet langer toegankelijk was. De overgang naar het protestantisme betekent dat alle katholieke elementen verwijderd moeten worden. Veel kunstwerken worden bij mensen thuis opgeslagen of overgedragen naar andere kerken die wel katholiek zijn. De gilden moeten hun eigen kostbaarheden ophalen.
Niet alleen het aanzicht, ook de beleving van de kerk verandert ingrijpend. Waar de Rooms-Katholieke eredienst gekenmerkt wordt door veel rituelen en gebruiken, is de protestantse eredienst veel soberder. Toch doet het stadsbestuur zijn best om alle goudenaren onder het dak van de Sint-Jan te verenigen. Dat vraagt om een enigszins liberale predikant. Na verloop van tijd benoemt men de voormalige monnik Herman Herbers als dominee. Hij schrijft de Goudse Catechismus, een leerboekje speciaal voor goudenaren. Jong en oud kunnen er de basisprincipes van het geloof uit leren. Al met al verdwijnt er veel door de alteratie, maar er komen ook nieuwe objecten en nieuwe mensen in de kerk.
