De inname van Den Briel in 1572 markeert een belangrijk keerpunt in de opstand tegen Spanje. Een aantal Hollandse steden verklaarde zich vóór prins Willem van Oranje. Na enige aarzeling sloot ook Delft zich daar bij aan. De keuze vóór de prins en tegen de Spaanse overheersing had verstrekkende gevolgen voor de stad. Willem van Oranje vestigde zich met zijn hofhouding in het Sint-Agathaklooster in Delft. Hij verkoos deze versterkte stad boven het niet ommuurde Den Haag. Regelmatig verbleef hij ook in andere steden, maar Delft werd toch het bestuurscentrum van waaruit aanvankelijk de opstand tegen Spanje werd geleid. De Leenkamer, de Rekenkamer en het Hof van Holland vestigden zich ook binnen de veilige muren van deze stad. De Staten-Generaal vergaderden incidenteel in het voormalig klooster. In Delft werden de grondslagen gelegd voor de nieuwe staat. Na zijn huwelijk met Louise de Coligny verbleef de prins vaak langere tijd in het Prinsenhof.
Willem van Oranje vormde zo’n grote bedreiging voor de Spaanse vorst Philips II, dat deze hem in 1580 vogelvrij verklaarde. Zijn moordenaar zou rijkelijk beloond worden. Diverse pogingen om hem te doden mislukten, totdat in 1584 de jonge Balthasar Gerards onder de schuilnaam François Guyon wist door te dringen in het Prinsenhof. Deze uit de Franse Jura afkomstige fanatieke katholiek had zich ten doel gesteld de prins te doden. Op 10 juli loste hij de fatale schoten die de prins het leven kostten. De reacties op de dood van de prins waren verdeeld: de aanhangers van de opstand zagen de moord op hun leider als een enorm verlies. Van de zijde van de rooms-katholieken zag men de dood van Willem als een geschenk uit de hemel.
Balthasar Gerards werd onmiddellijk na zijn daad gearresteerd en na een kort proces en wrede folteringen ter dood gebracht. Met veel pracht en praal werd het lichaam van Willem bijgezet in een grafkelder onder het koor van de Nieuwe Kerk. Het was niet mogelijk het stoffelijk overschot naar de grafkapel van de Nassaus in de Grote Kerk in Breda te brengen, omdat deze stad in handen was van de Spanjaarden. Na de dood van haar echtgenoot verbleef Louise de Coligny nog een paar maanden in het Prinsenhof. In november vertrok zij uit Delft om er pas na haar dood in 1620 terug te keren om begraven te worden in de Nieuwe Kerk. Bij de dood van Willem van Oranje verkeerde de opstand in een zeer kritieke fase. Zijn zoon Maurits zette de strijd tegen Spanje voort. Hij vestigde zich in Den Haag en met hem vertrokken ook de regeringsinstellingen uit Delft.
