De Reformatie vond in Twente aanvankelijk weinig weerklank. Pas toen prins Maurits in 1597 Twente ‒ waaronder ook Ootmarsum ‒ veroverde, werd de publieke uitoefening van de katholieke godsdienst verboden. In 1598 verscheen de eerste dominee in Ootmarsum in de persoon van Adolphus van Besten. Hoe de toestand zich in de daaropvolgende jaren ontwikkelde, valt op te maken uit het "Rekeningenboek van Ootmarsum 1561-1615". In dit kerkelijk rekeningenboek verantwoordde de pastoor van jaar tot jaar de door hem gedane uitgaven en de verkregen inkomsten. In de jaren 1597-1599 voerde nog steeds pastoor Fredericus van Delden de administratie. Wel moest hij in 1598 drie schepel rogge uitkeren aan "den nyen predekant". Adolphus van Besten werd in 1598 als dominee aangesteld, maar in 1599 was hij alweer uit Ootmarsum verdwenen. Er volgde een opeenvolging van voorgangers. Van 1602-1604 was Otto Gysius predikant te Ootmarsum. In deze periode werd de pastoor afgezet en nam de dominee de kerk over. Fredericus van Delden wordt niet meer genoemd. De rekeningen werden ondertekend door de predikanten: Valerius Rostorp (1604) en Fredericus Curtenius (1605).
Twaalfjarig Bestand
Dit alles was van korte duur. De Spaanse troepen heroverden onder leiding van Spinola in 1605 Oldenzaal en Twente werd weer katholiek. Fredericus van Delden nam zijn oude plaats als pastoor weer in. De predikanten namen de vlucht omdat ze de bescherming van de Staatse troepen moesten missen. In 1609 werd het Twaalfjarig Bestand getekend. De strijdende partijen spraken af elkaars bestaande territorium te respecteren. Desondanks probeerden beide partijen hun invloed uit te breiden. Voor Ootmarsum leidde dit tot een opmerkelijk incident.
Schermutselingen in de kerk
Op Pinksteren 1609 droeg pastoor Fredericus van Delden de mis op, toen twee soldaten in Staatse dienst de kerk binnenkwamen om hem te arresteren. De gelovigen kwamen hiertegen in opstand en riepen: "We laten de pastoor niet gaan, sla toe, sla toe!" De soldaten sloegen op de vlucht door het verzet van de parochianen. Ze konden met moeite ontkomen, terwijl ze met stenen werden bekogeld. Daarop gaf luitenant Dirk van Rhees de burgemeesters opdracht de pastoor uit te leveren. De burgemeesters antwoordden dat deze kwestie niet onder hun verantwoordelijkheid viel. De luitenant bleef uiteindelijk niets anders over dan rechtsomkeer te maken. Door deze verwikkelingen werd in een aanvulling op het Bestand bepaald dat in Twente op het punt van religie alles in de bestaande toestand gelaten zou worden. Het gevolg was dat de rooms-katholieke godsdienst in Ootmarsum bleef gehandhaafd tot de inname van de stad in 1626 door Ernst Casimir van Nassau.
In het verborgene
De openbare beoefening van het katholieke geloof werd vervolgens verboden en door de classis van Deventer werd Justinus Havenberg als predikant van Ootmarsum aangesteld. Pastoor Fredericus van Delden en zijn kapelaan Robert ten Ham bleven niettemin in het geheim missen opdragen. In 1628 sloten de Spaanse en Staatse partijen een overeenkomst, het zogenaamde "Interim van Roosendaal", waarin de katholieke eredienst in Twente weer werd toegestaan. Als gevolg hiervan kwam er een eind aan het verblijf van dominee Havenberg in Ootmarsum. De katholieken kregen de kerk en pastorie weer in hun bezit. Maar op 10 december 1632 werd het Interim door de Staten opgezegd. De "paepsche pastoor" Frederick van Delden en Robertus Ham, "cappellaan tot Ootmarsum" mochten geen kerkdiensten meer houden. Op 21 september 1633 werd Bernhardus Nijhoff benoemd tot predikant te Ootmarsum. Het leidde tot de confiscatie van kerk en parochiegoederen en de kostbare gouden kelken. De pastoor moest de weme (pastorie) verlaten. Voortaan waren de katholieken genoodzaakt in het verborgene hun godsdienst uit te oefenenen werd het protestantisme de bevoorrechte godsdienst.
